多巴胺熒光探針 繪制腦圖譜的“指路明燈”
一陣濃郁的蕉香襲擊著黑暗中的一只果蠅，它“嗡嗡”地興奮起來，振翅要湊過去?？萍既請笥浾呓兆咴L北京大學生命科學學院發現，研究人員正在試圖捕捉這只被釘在顯微鏡下的果蠅的“思想活動”。“我們可以直接觀測到，果蠅感應到氣味之后，腦中的多巴胺濃度變化。”正在做實驗的博士生曾健智說，“一會兒還會給它一些電信號刺激，觀察腦中多巴胺在不同刺激下的響應。”
“聞香起舞”這個簡單的畫面在“腦圖譜”的維度是復雜的——香蕉揮發出的香氣分子被果蠅的嗅覺細胞捕獲，激發了嗅覺細胞通路中的信號轉換，將化學信號轉變為神經電信號傳送至腦，電信號的到來催促著體內多巴胺的分泌，通過打開細胞內的通路，將神經信號中氣味分子的信息傳遞出來。
如同“多米諾骨牌”，外界的刺激一張張傳遞下去，激起了生物體的反應。由于多年來對活體動物思維的即時、定位觀測始終未能實現，這些反應具體發生在大腦中的哪個部分，人類仍無從得知。日前，新一期《細胞》雜志刊登了北京大學生命科學學院研究員李毓龍團隊的研究成果：通過基因構建的方法，他們開發出多巴胺熒光探針，宛如在深邃的思想迷宮中點燃“火把”，為此類相關研究“照亮”了多巴胺神經環路。
動態示蹤多巴胺信號變化
“將水母中的熒光基因和人源G蛋白偶聯受體(GPCR)基因聯合在一起，我們獲得了可以動態示蹤多巴胺的工具。”李毓龍告訴科技日報記者，這聽起來很簡單，但是神經活動的特性對探針提出了嚴苛要求。神經活動是稍縱即逝的，它必須反應迅速;多巴胺的生成可能是痕量的，因此它必須敏銳;示蹤多巴胺必須可信不“犯錯”，它必須準確無誤……只有符合這些鐵一般的律條，才具備資格成為廣泛應用的研究工具。
打磨工具的“原材料”正是能夠和多巴胺結合的GPCR。“它是一個跨膜蛋白，它在結合多巴胺后會引發自身的構象變化，我們想，如果能夠讓這樣的構想變化產生熒光，或能解決問題。”論文第一作者之一的北京大學生命科學學院博士井淼解釋道。這可以通俗地比喻為，多巴胺“按下”的按鍵此前只打開了大門，而要打造的新工具能讓打開的大門同時亮燈。
為此，團隊選擇了5種GPCR亞型作為備選原材料。“我們利用分子克隆的方法將編碼熒光蛋白的基因與五種多巴胺受體的基因拼接起來，通過對融合蛋白的表達、定位及受體對多巴胺的親和力等指標篩選出最好的亞型。”井淼說。
人工“拼接”后的基因表達會不會被細胞“認可”?打造一款高效“探針”的第一個阻礙來自細胞內部。“正常的GPCR是膜蛋白，要檢測細胞外出現的多巴胺信號，蛋白必須要上膜，加了熒光蛋白以后，GPCR的性質可能會變化，無法上膜。”井淼說。
精密運轉的細胞在“零件”被改變之后能否正常運轉、經過修飾的全新蛋白能否“繼承”原有的功能、基因遵循密碼子原則轉錄翻譯為氨基酸序列之后的蛋白裝配是否能完成抵達細胞膜發揮作用的任務等都是擺在課題組面前的“攔路虎”。
抵達膜上僅僅是第一步。“要想GPCR接受信號分子多巴胺后產生的扭轉牽動熒光蛋白扭轉后發光，兩個蛋白的連接方式起決定作用。”井淼解釋，“有的情況下，受體的構象改變可能無法有效傳遞給熒光蛋白以產生熒光變化。”
知己知彼，百戰百勝。由于對GRCR蛋白三維構象、核心基團、結構作用力等的精準了解，李毓龍團隊對其基因水平上的改造和雕琢，能夠做到恰到好處。實驗證明，長時間表達該探針對模式生物的生長狀態無明顯影響。利用該探針，他們檢測到了電刺激小鼠腦片引發的多巴胺釋放，并在活體果蠅、斑馬魚和小鼠的大腦中檢測到了與嗅覺刺激、視覺刺激、學習記憶、交配行為相關的多巴胺信號變化。
精益求精，探針靈敏度不斷“進化”
“人們可能從來不知道這里有神經信號釋放，但是如果有一個非常靈敏的探針，就可能會看到。”井淼說，文章接收后，團隊始終在進行探針的優化工作，如今的探針比論文中的更加靈敏。
如果將人腦比喻成一張聯絡圖，科學家想要做的是按圖索驥，尋找例如記憶、情感等對應的神經活動的詳細內容。而未來這張圖的清晰度如何，是雪花、省流、標清、高清還是1080P，則完全取決于探針的靈敏度。
在突破了第一個阻礙之后，探針迎來了“修煉式”優化。“我們知道要把熒光蛋白的基因和特定的GPCR基因連在一起，可是怎么連才最優呢?”井淼說，靠左一點還是靠右一點，也可能需要在中間加一座連接的橋梁，橋梁又該怎么設計，這其中能排列組合出的方案數不勝數。
“我們通過找到一些對探針與多巴胺反應起到關鍵作用的位點，對基因進行定點突變，取得了探針優化的效果。”井淼介紹，實驗中突變帶來的結果可能有好有壞，突變后會測試其與多巴胺的反應，篩選出“改良版”，這些“改良版”隨后還會進行組合嘗試，不斷篩選與優化，向著更高的靈敏度“進化”。經過500多個突變的嘗試，團隊最終獲得了具有高、低親和力的兩種版本探針，適用于多巴胺釋放量不同的腦區。
李毓龍認為，探針靈敏度在未來的持續優化和篩選中將可能不斷提高，使其有能力示蹤更多未知的神經通路，發現人類不曾觀測到、還不知曉的神經系統秘密。
捕捉神經活動，從“閃爍”變為“多彩”
由于神經元在放電的時候會爆發出一個短暫的鈣離子濃度高峰，神經元鈣離子成像技術至今依然是人們觀測神經活動最為直接的手段。“雖然鈣離子成像能夠同時反應成百上千個神經元活動，但由于許多神經遞質都可以引發細胞內鈣信號的變化，因此單純通過鈣成像難以知曉是何種神經遞質在發揮作用。”井淼說。
有文章評價，有了鈣成像技術，原本悄無聲息的神經活動就變成了一幅閃爍的壯觀影像。然而這種“全面開花”的成像方式難以“定點”“定性”反應精細的問題。
“神經元的興奮性變化是否是多巴胺介導的?是某一個神經元細胞始終分泌了多巴胺，還是分階段分泌不同濃度的多巴胺?是一整個神經元細胞的活動，還是神經元細胞中不同突觸的活動?回答這些問題，才有可能弄清一些神經系統疾病的病理，從而有針對性地開發藥物。”李毓龍說。
如果說，鈣離子成像技術解決的是科學家終于可以“目擊”神經信號在神經網絡之中往來穿梭的問題，那么多巴胺熒光探針技術解決的是逐一“狙擊”神經信號與現實的對應關系。
與此同時，李毓龍團隊還首次成功開發了靈敏、特異、可遺傳編碼的乙酰膽堿熒光探針，并成功在不同生物體系中實時檢測內源乙酰膽堿信號，相關論文日前已在《自然·生物技術》雜志發表。可以想見，當每一種神經遞質有一個不同顏色的探針對應，那神經活動將從之前的“閃爍”變為“多彩”，不同顏色代表不同的神經活動。有了趁手的工具，人們將在獲得“腦圖譜”的研究中邁進一大步。
